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宫颈癌蛋白质组学研究进展课题研究

2019-12-15 07:50:51来源:论文阁作者:佚名

导读: 关于宫颈癌的论文《宫颈癌蛋白质组学研究进展课题研究》,作者:闵卫利,苏宝山,杨军,李牧,高艳娥,仵文英 【关键词】 宫颈癌 [摘 要] 蛋白质是生命活动的执行者,利用蛋白质组学的方法检测蛋白

关于宫颈癌的论文《宫颈癌蛋白质组学研究进展课题研究》

作者:闵卫利,苏宝山,杨军,李牧,高艳娥,仵文英

【关键词】 宫颈癌

[摘 要] 蛋白质是生命活动的执行者,利用蛋白质组学的方法检测蛋白质谱的变化,将有助于肿瘤的诊断和治疗。本文就蛋白质组学在宫颈癌组织蛋白中的表达、HPV致癌机制、化疗药物作用机制等方面的进展做一概述。

  [关键词] 宫颈癌;蛋白质组学;2DE;质谱;HPV

  宫颈癌发病率居全球女性恶性肿瘤的第二位,每年约有50万宫颈癌新发病例,其中
80%在发展中国家,我国每年约有新发病例13.15万,占世界新发病例的28.8%。近年来宫颈癌发病率有明显增高及年轻化的趋势,严重威胁广大妇女健康的疾病。蛋白质组学的兴起为宫颈癌的研究提供了理想的技术平台,对寻找其相关生物标记、探讨其发病机制、开发新的药物等有着重要的意义。

  1 宫颈癌标记蛋白

  目前诊断宫颈癌主要依据宫颈细胞学涂片检查,但其早期诊断阳性率较低,因此寻找早期诊断和治疗宫颈癌敏感、有效的方法极较迫切。Govorukhina等[1]用特异抗体、染料配基(针对清蛋白)、蛋白A或G(针对球蛋白)使宫颈癌患者血中的白蛋白和球蛋白耗竭,然后用SDSPAGE和LCMS法检测到ng/ml水平的SCCA1。说明蛋白组具有高度的敏感性和准确性,可用来寻找新的肿瘤标志物。在肿瘤发生发展中,常伴有某些蛋白质被表达或抑制,确定和筛选特异的肿瘤标志物将有助于肿瘤的早期诊断、治疗和预后评价。Trejo等[2]使用SDSPAGE方法对正常宫颈细胞及宫颈癌细胞的膜蛋白进行检测发现,29例正常的宫颈细胞中有一种高度表达的蛋白质;而48例肿瘤细胞中则有三种预示病人有一个完全的临床反应的蛋白质,并有一种高分子量蛋白表达下调或丢失。但是没有检测到与肿瘤临床病理相关的蛋白。Matsui等[3]使用2DE和MALDITOF~MS技术在ME180宫颈癌细胞中鉴定出IFNγ、TNF调节蛋白和三种细胞因子调节蛋白(丙糖酸磷酸化异构酶、蛋白酶体亚单位C3及GTP连接蛋白RAN)。Sahota等[4]使用WSQ4蛋白芯片(020000Da),在50例患者(包含宫颈癌和非癌患者)中检测到32个蛋白峰,它们全部出现在阳性组或对照而在另一组缺如。说明宫颈癌组细胞的蛋白与非癌组有明显差异。

Wonga等[5]使用SELDI技术和WCX2蛋白芯片检测35例浸润性宫颈癌(17例早期,18例中晚期)和2例正常组织的蛋白情况:检测到50个蛋白峰;进一步双盲选择35例患者(20例癌,15例正常),在癌中2个蛋白下降,13个蛋白升高;然后通过AUC挑选出7个蛋白(这些蛋白在肿瘤均下降)区分癌的敏感性87%,特异性100%,阳性预测值100%,阴性预测值87%。但是在早期和晚期组之间没有检测到特异的分子。研究显示SELDI技术具有高通量、高敏感、高特异等特点,可应用于宫颈癌早期诊断。除了分析整个癌细胞蛋白,单独分析细胞核的蛋白也引起人们的关注。Keesee等[6]通过2DPAGE检测到20例宫颈癌NMP(核内的非染色体结合蛋白)有5个多肽链,而在10例正常组织未检测到。另有研究显示用NMP179检测宫颈高度鳞状上皮内病变有96%的敏感性[7],提示其可用于宫颈癌前病变诊断。宫颈轻中重度不典型增生(CIN1、CIN2、CIN3)如及时治疗分别有15%、30%、60%的癌变这一过程。寻找癌与不典型增生的差异对癌变的干预性预防有重要意义。Keesee等[8]用蛋白组学检测宫颈的不典型增生上皮,发现EGFR和TfR检测宫颈上皮重度不典型增生有较高的准确性(100%、96.3%)。Eggeling等[9]用显微切割技术和SAX2芯片研究3例宫颈癌标本和4例宫颈上皮瘤标本发现:12027Da在癌中过度表达,10205Da,10953Da,12738Da,13283Da在上皮瘤中过度表达。说明这四个蛋白可能与肿瘤的浸润有关。从宫颈癌的蛋白研究可看出:正常组织与肿瘤组织蛋白不仅有量的差别,也有质的区别;蛋白组学在研究组织蛋白方面有明显的优势,可用于肿瘤在早期诊断;也为建立宫颈癌蛋白组数据库提供丰富资源和研究方向。

  2 HPV与宫颈癌

  HPV广义上分为低危组和高危组,高危型HPV (16、18型等)主要引起重度不典型增生和浸润癌。探讨HPV引起宫颈癌细胞蛋白变化对其诊治有重要意义。Choi等[10]用蛋白组分析感染和未感染HPV 的HaCaT细胞(人永生角化细胞株)和宫颈鳞癌细胞蛋白(共64个电泳点核31个,浆蛋白33个)显示:感染组与非感染组在原癌基因及癌基因产物、细胞周期调节蛋白、基因稳定调节蛋白、端粒酶活性、细胞的永生化程度等方面明显不同;并发现Mdm2、Mdm4与E6癌蛋白致癌密切相关;HPV的致癌可能与抑制G2期宫颈细胞有关;但在HPV16感染组与HPV18组之间的细胞蛋白没有明显区别。此研究进一步证实了HPV在宫颈癌的发生、发展起着重要作用,并有一定的共性,但是有无特异性蛋白还需进一步研究。

  2.1 HPV E5、E6、E7蛋白的致癌机制 蛋白与蛋白之间相互作用是蛋白组研究的另一个重点,HPV编码6个~8个早期蛋白(E1~E8)和2个晚期(L1~L2),其中 E5、E6 和 E7属于细胞转化蛋白,是致癌的关键分子。研究HPV癌蛋白对细胞蛋白的影响引起人们广泛关注。Leykauf等[11]用蛋白组检测转染HPV16 E5的HaCaT细胞膜蛋白的表达情况:calnexin下调,hsp70与MHC一类复合体成熟和转移蛋白上调。同时发现MHC一类分子在E5表达细胞、HPV阳性宫颈组织、宫颈癌细胞均表达上调。这些结果说明E5蛋白致癌的复杂性,并为研究抗癌疫苗提供丰富的资源和方向。Yim等[12]分析转染HPV16 E6的直肠腺癌RKO和肺腺癌A549蛋白组发现,与对照组相比PKO有13上调,13下调;A549有12上调,14表达下调。其中转录因子DP2(TFDP2) 和 E2F1表达上调说明E6可能与肿瘤发生有关。Lee等[13]用2DE和MALDITOFMS技术检测转染HPV16 E7的宫颈癌细胞系(C33A)检测到47个蛋白。二硫化物异构酶 A3,整合酶作用蛋白1,细胞骨架蛋白,生长抑制蛋白,GSTP和原癌基因vav表达等36个蛋白被E7抑制,而HSP1(60KA),Ku70连接蛋白,α烯醇化酶,蛋白酶体亚单位26S等11个蛋白上调。进一步基因分析示IL12R β1,细胞色素c,和TNF受体Ⅱ被E7高度诱导。这些结果提示E7介导癌细胞的免疫逃逸可能与抑制或诱导细胞信号因子、细胞调节因子、分子伴侣有关,并为进一步研究E6致癌机制和开发抗病毒药、抗癌药提供有用的新信息。Shim等[14]用2DE和MALDITOFMS技术探讨表达E7的HaCaT细胞对氧化族介导的凋亡耐受机制:过氧化氢酶表达升高和其启动子、活性升高,抗氧化酶Prx2(peroxiredoxin 2)上调,减少细胞内活性氧水平,并且这个过程独立于P53、Rb途径,另外发现NFκβ(过氧化酶基因启动子调节剂)由E7介导。我们从这些结果得出HPV 16 E7癌基因介导的E7感染细胞对氧化族介导的细胞死亡高度耐受,可能主要通过调节几个包含过氧化氢酶在内的几个抗氧化酶类。过氧化酶和Prx2上调可能是HPV感染和致癌的细胞逃逸机体免疫的重要机制。

  综上所述,蛋白组技术在研究病毒及其基因生化特性方面有很大优势,对更深入了解HPV引起宫颈癌的机制及干预性预防有重要意义。

  3 宫颈癌对化疗药反应机制

  宫颈癌传统的治疗手段是手术及放疗,但手术和放疗对宫颈癌仅是局部治疗,不能控制肿瘤的微转移灶,因而化疗重新受到了重视,特别新辅助化疗,但耐药是化疗失败的重要原因之一,所以药物抗癌机制、耐药机制是肿瘤研究的热点之一。5氟尿嘧啶、顺铂、紫三醇是目前常用疗效肯定的宫颈癌化疗药物。Yim等[15]应用蛋白组学分析5氟尿嘧啶处理宫颈癌后的抗增殖效果,与对照组相比50多种蛋白质显示重要改变,其中34种由2DE和MALDITOFMS及肽指纹图谱鉴定,有22种上调,12种下调。显示5氟尿嘧啶参与了线粒体凋亡途径。采用蛋白组技术Lee等[16]发现紫三醇抑制宫颈癌细胞(HPV16阳性CaSki,HPV18阳性HeLa,HPV阴性C33A)的有丝分裂蛋白BUB3,提高凋亡相关蛋白、免疫应答相关蛋白、细胞周期控制蛋白;减少生长因子、癌蛋白、转录调节蛋白;其抗肿瘤是通过包含caspase8活化(独立于TRAIL)的膜死亡受体介导的凋亡途径和线粒体介导的凋亡途径(包含细胞色素c释放和bcl2下调)实现的。Annalisa等[17]用蛋白组学技术对比A431、暴露于顺铂的宫颈癌细胞系A431(A431 Pt)、耐顺铂的A431(A431/Pt)、暴露于顺铂的耐药细胞(A431/Pt Pt)四种细胞之间的蛋白发现:A431 Pt中GST1、HSP60、HSP90、BCL2、抗凋亡蛋白1433、过氧化物酶PRX1 G6P脱氢酶表达升高,钙结合蛋白下降;A431/Pt中HSC71、HSP60表达上调,钙结合蛋白下降;A431/Pt Pt中BCL2,1433,PRX6,离子通道VDAC1,磷酸甘油酸转移酶1表达升高,钙结合蛋白下降。这些研究显示顺铂介导耐药是包含了热休克蛋白、抗凋亡蛋白、钙调蛋白、氧化还原代谢酶等多因子的复杂事件,对制定新的干预治疗方案有重要意义,并为进一步研究药物作用机制提供丰富资源和方向。

  综上所述,化疗药物作用机制、耐药机制是十分复杂的,诱导癌细胞凋亡是它们的一个重要方面。蛋白组学对肿瘤治疗机制研究方面不可替代的优势,因为其具有信息力大、高度的敏感性等特性。

  4 问题与展望

  近年来,癌蛋白质组学研究发展迅速,已鉴定出多种具有诊断和治疗潜能的生物分子靶标,但作为一种新的研究方法还存在着问题:因为蛋白质本身结构的复杂性,对于极端酸性、碱性、低拷贝、难溶性蛋白质的分离目前仍是难点,需要技术上的突破。目前常规双向凝胶电泳上只能分辨到3 000个~4 000个蛋白质点,这离估计的细胞总蛋白质数目还相差太远,通过此方法分离的真核组织蛋白点有20%的点包括2种或2种以上蛋白质,这无疑为研究结果的判定带来了困难;另外在蛋白质组学研究中,样品的制备也存在一些不足。目前宫颈癌的蛋白质组学研究中的样品来源主要是宫颈癌细胞系、宫颈癌患者血清和宫颈癌组织。宫颈癌细胞系虽然制备容易,但不能完全体现体内的真实情况。而且也有研究发现肿瘤细胞即使经过短暂的体外培养,细胞内的蛋白也可发生明显改变。应用肿瘤组织时,由于肿瘤组织内混有血清蛋白质成分、基质成分和坏死组织成分等,会影响针对肿瘤细胞蛋白质组的分析。近年发展的激光捕获显微切割(laser capture microdissecti-on,LCM)技术[18]可以使研究者从复杂的肿瘤组织中分离出肿瘤细胞,利用激光捕获纯的肿瘤细胞,极大降低了对癌变组织的蛋白质组的分析背景干扰,提高了分辨率,并有助于比较正常组织和肿瘤组织蛋白质表达的差异。Banks等[19]用LCM验证了该方法的可行性。避免了其他蛋白成分对双向电泳结果的影响。蛋白质组学因为是对细胞内的总蛋白同时进行研究,所以需要高通量鉴定蛋白质点,且自动化程度越高越好,对样品的需要量越少越好。LCM 和2DE结合是当前应用最普遍的肿瘤蛋白质组学研究方法之一[20],随着蛋白质组学在技术上和理论上的不断发展和完善,它将在肿瘤及生命科学的各个学科中发挥越来越重要的作用,从而成为揭示肿瘤发生本质、诊断和治疗肿瘤的有力武器。

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